Шаг от большой молекулы белка в сторону уменьшения размеров молекул-имитаторов

Finberg R.W. et al. [1990] внимательно присмотрелись к эпитопу в молекуле CD4, который считается непосредственным сайтом связывания с вирусным gp120 (аминокислоты NN 31-57), и сосредоточили внимание на остатке фенилаланина в позиции N 43, про который известно, что замена его направленным мутагенезом, например, на лейцин, приводит к полной утрате способности молекулы CD4 связываться с gp120 ВИЧ. Авторы выбрали группу (четыре стереоизомера) соединений с низким молекулярным весом, а именно дипептид пролил-фенилаланин, модифицированный с N-конца присоединением карбо-метокси-карбонила, а с С-конца – бензилового эфира. Такое вещество называется N-карбо-метокси-карбонил-пролил-фенилаланин-бензиловый эфир, в английской аббревиатуре – CPF. Оказалось, что CPF эфективно конкурируют с белком CD4 за связывание с вирусным gp120. При этом CPF, связав gp120, предотвращают иммуносупрессорное действие gp120 в отношении контакта CD4 с антигенами Н-го класса ГКГС.
CPF протестировали на культурах клеток Н9, HSB-2 (лейкемические пре-Т-лимфоциты, трансфецированные геном CD4) и на свежевыделенных Т-лимфоцитах из периферической крови человека. При всех трех вариантах клеток-мишеней CPF эффективно предотвращают их инфицирование при внесении в культуру вирусов ВИЧ-1 IIIВ или равно ВИЧ-1 MN. Процесс блокировки вирусной инфекции имеет характер гиперболической зависимости от концентрации CPF в среде. Выраженная блокировка наступает при концентрациях CPF от 160 мкг/мл и выше, и проходит эффективнее при инкубации при 37°С в течение 1 часа, чем при 4°С. Наибольшая биологическая активность у стереоизомера CPF, состоящего из обеих неприродных D-аминокислот. Остальные три стереоизомера также обладают биологической активностью, но несколько меньшей. Молекулярный вес CPF 438 дальтон. Исследовали также шесть производных от CPF. Оказалось, что замена боковых цепей и их спейсерных групп приводит к утрате биологической активности.
Эффект  CPF специфичен  именно для ВИЧ.  Это вещество не обладает противовирусной  активностью  в  отношении  таких  исследованных вирусов как пикорнавирусы – коксаки ВЗ и вирус эхо 1-го типа.
CPF во всех испытанных концентрациях не влияли на биосинтез собственных белков клетки. CPF не блокируют продукцию интерлейкина-2, зависящую от взаимодействия CD4 с антигенами Н-го класса ГКСГ (показано на клетках Т-гибридомы). Мало того, они не позволяют блокировать продукцию этого лимфокина вирусному гликопротеиду gp120. Если препарат инфекционного вируса ВИЧ проинкубировать в течение всего одного часа с 200 мг/мл CPF и затем внести в культуру клеток линии Н9 (восприимчивой к заражению ВИЧ), то даже через несколько суток последующего культивирования в клетках не удается обнаружить РНК вируса таким методом, как гибридизация Northern blot со специфическим зондом. То есть, блокировка вирусного паратопа препаратом CPF не является быстро обратимой. На уже состоявшуюся внутриклеточную инфекцию CPF, естественно, влияния не оказывают.
Таким образом, проведенное исследование показывает, что CPF достойны внимания в качестве кандидатов на клинические испытания.
В заключение отметим, что разные разновидности и изоляты вирусов иммунодефицита человека связываются с рецептором CD4 с различной силой (аффинитетом). Moore J.P. et Morikawa Y. [1991] измерили константы ассоциации растворимой молекулы CD4 с растворимыми оболочечными белками ВИЧ-1 IIIВ – gp120, а также из вируса второго типа ВИЧ-2, изолята ROD – gp120. В случае, если gp120 и gp105 выделяли из нативных вирионов с применением детергента Empigen zwitterionic, то константа ассоциации gp120 с CD4 в 25 раз превосходила константу ассоциации gp105 с CD4. Чтобы снять вопрос относительно возможного вмешательства детергента, использовали также рекомбинантные белки gp120 и gp105, полученные при экспрессии рекомбинантных бакуловирусов и аффинноочищенные без применения детергента. В этом случае константа ассоциации gp120 все равно превосходила константу ассоциации gp105 минимум в 15 раз. Таким образом, вирус иммунодефицита второго типа связывается с рецептором CD4 на порядок с лишним слабее, чем это делает вирус иммунодефицита первого типа.
Показано также, что многие первичные изоляты ВИЧ-1, свежевыделенные от больных людей, связываются с CD4 слабее, чем лабораторный штамм-прототип ВИЧ-1 IIIВ.