Препараты растворимого фрагмента CD4

После того, как выяснилось, что растворимый фрагмент внеклеточной части молекулы CD4 способен in vitro полностью блокировать инфекцию живого вируса ВИЧ в СБ4-позитивные клетки-мишени, причем независимо от изолята ВИЧ (из исследованных лабораторных штаммов), было выполнено большое количество работ по получению растворимых рекомбинантных препаратов CD4. Использовали самые разные системы экспрессии, трансфекцию и/или трансдукцию гена, кодирующего CD4. Мы приведем ряд конкретных примеров систем экспрессии с той целью, чтобы создать представление о многообразии репертуара экспериментальных методов и объектов.
Arthos J. et al. [1989], Fisher K.A. et al. [1989], Deen K.C. et al. [1988] и другие трансфецировали ген CD4 в составе различных векторов экспрессии в перевивные клетки млекопитающих линии СНО (клетки яичника китайского хомяка), дефектные по ферменту dhfr – дегидрофолат редуктазе. Этот метаболический дефект позволяет проводить селекцию трансфектных клеток путем культивирования смеси клеток в присутствии метотрексата – ингибитора dhfr. В такой системе выход растворимого CD4, секретируемого трансфектными клетками в супернатант, составляет 1-5 мкг/мл.
Deen et al. получали по 40 мг sCD4 с литра культуры за четверо суток культивирования. Отсюда расчетная средняя продуктивность культуры у этих авторов – не менее 3 нанограмм CD4/Ha одну клетку в сутки. В концентрациях, не превышающих 10 мкг/мл, растворимый CD4 никак не влияет на пролиферацию и жизнеспособность культивируемых клеток-мишеней для ВИЧ.
Traunecker A. et al. [1988] трансфецировали фрагмент гена 1-го и 2-го доменов CD4, соединенного с геном константной части каппа-цепи иммуноглобулина и промотером от гена тяжелой цепи иммуноглобулинов в составе вектора экспрессии pHTL/1-Yl в клетки миеломы мыши Х.63.0. Метод трансфекции – слияние протопластов. Адекватный метод селекции -культивирование в среде с микофеноловой кислотой и ксантином. У этих авторов нейтрализующая ВИЧ концентрация такого препарата CD4 – 30 нанограмм/мл для тест-систем in vitro.
Bowman М.Р. et al. в упоминавшейся уже работе [1988] использовали двухэтапный подход. Сначала они трансфецировали ген внеклеточной части молекулы CD4 в клетки линии DAMP, прединфицированные ретровирусом NL. В этих клетках ген CD4 включался в состав генома ретровируса и попадал с созревшими вирионами в культуральный супернатант. Последний использовали  как   источник  рекомбинантного  ретровируса   для заражения клеток Т-лимфоцитарной гибридомы By 155.16. В этих клетках, трансдуцированных рекомбинантным ретровирусом, ген CD4 встраивался в собственный геном клетки. Отбор трансдуцированных клеток, в которых налаживалась хорошая продукция CD4, проводили методом двухцветной проточной лазерной цитофлюорометрии с применением моноклональных антител анти-СБ4 (ОКТ4А) и анти-Т-клеточного рецептора для антигена (F23).
Hussey R.E. et al. [1988] разработали новую систему экспрессии растворимого CD4 в культивируемых клетках насекомых Spodoptera frugiperda. Линия клеток называется SF9. Клетки SF9 легко трансдуцируются рекомбинантным бакуловирусом ACMV, в состав которого ввели гомологичной рекомбинацией фрагмент гена внеклеточной части молекулы CD4 (вектор рАс3734). В данной системе 45% белка, продуцируемого в среду культивирования трансдуцированными клетками SF9, составлял растворимый CD4. Полная ингибиция индуцированного ВИЧ синцитиообразования в тест-культурах клеток Т-лимфоцитарных линий Н9 или С8166 достигалась при концентрации полученного препарата sCD4 в среде 2 мкг/мл.
Mizukami Т. et al. [1988] (об этой работе выше также шла речь) получали экспрессию внеклеточного фрагмента CD4 в системе трансдукции части гена CD4 в составе рекомбинантного вируса осповакцины в культивируемые клетки почки обезьяны CV-1.