Ген nef – negativ factor

Этот регуляторный ген был идентифицирован как еще одна открытая рамка считывания в 3′-конце генома ВИЧ в нескольких независимых лабораториях одновременно. В разных работах этот участок генома раньше называли 3′-orf (open reading frame), то есть 3′- открытая рамка считывания, или orf В, или Е′, или F.
Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов данного гена показал его высокий консерватизм у разных изолятов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV-1 (вирус иммунодефицита обезьян 1-го типа).
Делеция или денатурирующая мутация в гене nef приводит к тому, что в клетках, инфицированных мутантными по nef ВИЧ, продукция новых ВИЧ снижается. Если клетки-мишени имеют С04-рецептор, то снижение репликации происходит в 30-50 раз по сравнению с немутантным ВИЧ. В клетках, не экспрессирующих CD4, снижение происходит в 2-10 раз [Niederman T.M.J, et al., 1989]. В этой же работе показано, что BH4-nef(+) и BH4-nef(-), полученные в клетках линии COS-1, одинаковы по свойствам связывания с клетками-мишенями, проникновению внутрь клеток, активности их обратной транскриптазы. Тот же Niederman T.M.J, et al., а также Ahmad N., Venkatesan S. [1988] провели эксперименты, из которых следует, что nef оказывает транс-супрессорный эффект на репликацию ВИЧ. Для этого ген nef вместе с длинным концевым повтором ВИЧ в виде отдельной плазмиды (pNLVl02) трансфецировали одновременно с плазмидой, содержащей полноценный инфекционный провирус, р432. В качестве клеток-мишеней использовали линии SW480, CV-1, COS-1, Vero, Hela S3, A3.01. Максимальную продукцию вируса зарегистрировали в клетках линии SW480. При этом ко-трансфекция плазмиды с дополнительным геном nef приводила к снижению продукции вируса минимум в два раза. Если параллельные плазмиды содержали не целый провирус, а гены отдельных структурных белков – gp160, gp120 или gp41, то ко-трансфекция плазмиды с nef плюс LTR снижала продукцию этих структурных белков примерно на 90% по сравнению с контролем, то есть плазмидами структурных генов без плазмиды с nef. Эффект негативной регуляции наблюдали только в том случае, если последовательность нуклеотидов гена nef в плазмиде была той же векторности (sense), что и генов структурных белков, но не противоположной (anti-sense).
К сожалению, другие авторы не подтвердили только что описанные результаты. Kim S.Y. et al. [1989] работали с изолятом ВИЧ-1, одноименным с тем, с которым работали Ahmad N. et al., то есть HIV-1-432. A Hammes S.R. et al. [1989] работали с векторами экспрессии, одноименными с теми, с которыми работали Niederman Т. et al. И у Kim S.Y., и у Hammes S.R. вирусы, имеющие полноценный ген nef, реплицировались несколько лучше, чем мутантные вирусы с неполноценным геном nef. По-видимому, в этих генно-инженерных экспериментах содержатся еще какие-то неизвестные переменные, которые авторы не принимают в расчет при интерпретации результатов, так как не знают об их существовании. Так или иначе, однозначный вывод о функции продукта гена nef на сегодня не сделан.
Тем не менее, известно, что продукт гена nef – это протеин Nef с молекулярным весом 24-25 kD или 27 kD. Форма р25 миристилирована с N-конца, а также фосфорелирована по треонину в позиции N 15. Форма р27 не миристилирована, но фосфорелирована по другой позиции, чем Thr-15 (по какой – неизвестно). В клетке белок Nef локализован преимущественно в цитоплазме. Финские ученые [Ovod V. et al., 1991] показали иммуногистохимическим методом с использованием панели из 10 монокло-нальных антител мыши, специфичных к Nef, что, по крайней мере, в клетках линий Н9 и МТ-4, инфицированных ВИЧ-1 BRU, больше всего протеина Nef локализавано в аппарате Гольджи (Golgi), но кроме этого Nef экспрессирован на мембране ядра, и (на части препаратов клеток МТ-4) -внутри ядра.
В той же работе финских исследователей с помощью панели из 24-х 20-ти членных перекрывающихся пептидов из последовательности Nef (использовали препараты липопептидов – торцевых конъюгатов пептидов с N-пальмитоил-S[2,3-bis (пальмитоилокси) - (2RS) - пролил] -(R)-цистеинил-(S)-серил-(S)- серином) показали, что полученные 10 моноклональных антител связываются с 7-ю эпитопами на молекуле Nef. Эти эпитопы следующие: 21-41, 31-50, 51-71, 61-80, 151-170, 161-180, 171-190. Все 10 моноклональных антител реагировали с естественным белком Net из изолята ВИЧ-1 BRU. Восемь из десяти антител реагировали с белком Nef из изолята ВИЧ-1 IIIВ.
Белок Nef связывает с высокой авидностью гуанозинтрифосфат (GTP) и проявляет ферментативную активность гуанозинтрифосфатазы (GTP-азы). Отсюда следует предположение, что Nef как GTP-аза ингибирует различные внутриклеточные передачи сигналов, в которых участвует GTP. Экспериментально показано, например, что белок Nef ингибирует экспрессию на клетках молекулы CD4 [Guy В. et al. 1987].
Glazer R. et al. в сотрудничестве с лабораторией К.Gallo провели молекулярно-генетические эксперименты с 3′областью генома ВИЧ, показавшие следующее. Известно, что в жизненном цикле ВИЧ какую-то биохимическую роль играет фермент протеинкиназа (ПК). Неизвестно, является ли ПК вирусной по происхождению, или ВИЧ использует какую-то клеточную ПК? В эксперименте получили мутантных вирусов ВИЧ с делецией 85 пар нуклеотидов в области генома 3′-orf. В результате продукт с делецированного гена не имел в своем составе аминокислот NN 26-53. Лизаты нативного и мутантного вирионов поместили в бесклеточную систему транскрипции-трансляции и целенаправленно исследовали эндогенное фосфо-релирование в присутствии ионов либо магния, либо марганца и меченого радиоактивным фосфором (32)Р аденозинтрифосфата. Результаты показали, что лизат нативного вируса ВИЧ-1 IIIВ обеспечивает зависимое от марганца фосфорелирование. Субстрат этой фосфорилазной активности – вирусный белок из группы gag р17. Моноклональные антитела против р17, а также сыворотки больных СПИД ингибируют это фосфорелирование. Фосфорелирование проходит по остатку серина. Фракционирование вирусного лизата гельфильтрацией и высокоэффективной жидкостной хроматографией показало, что фосфорилазная активность ассоциирована с белком с молекулярным весом 20-30 kD.
Мутантный вирус с делецией 3′ -orf не проявлял описанной или какой-либо фосфорилазной активности. Отсюда следует, что возможно, что продукт гена nef является фосфорилазой (протеинкиназой), обеспечивающей фосфорелирование вирусного белка р17 (возможно, и других). Возможно, однако, что протеин Nef и протеинкиназа – это разные белки, кодируемые одной генетической областью, но по разным рамкам считывания при трансляции. Ответ – в еще не выполненных трудоемких работах по секвенированию [Aquino et al., 1988].
Сотрудники из лаборатории того же R.C.Gallo провели экспериментальное исследование предположения – не является ли продукт гена nef ответственным за супрессию репликации и цитопатогенного действия ВИЧ в клетках обезьян шимпанзе. Известно, что ВИЧ-1 способен инфицировать лимфоциты шимпанзе, но в отличие от лимфоцитов человека – без цитопатогенных последствий для клеток. В опытах лимфоциты из периферической крови человека и лимфоциты из периферической крови шимпанзе заражали клонированным вирусом ВИЧ-1 HXB2D/HX10 или полученным из него мутантным вирусом delta-XC с делецией в области З′-orf. Через 7 суток культивирования лимфоциты человека, зараженные как исходным, так и мутантным по 3′-orf вирусом, погибли на 30-50%, тогда как жизнеспособность лимфоцитов шимпанзе, зараженных исходным или мутантным вирусами, не различалась в течение 1-4 недель культивирования. Экспрессия вирусных антигенов в клетках шимпанзе к 14-ым суткам резко упала по сравнению с лимфоцитами человека, причем равно как при инфекции исходным, так и при инфекции мутантным вирусами. Отсюда сделали вывод, что за супрессию процессов репликации вируса в лимфоцитах шимпанзе продукт(ы) 3′ -orf-области генома ВИЧ не отвечают [Looney et al., 1988].