Транс-активирующий эффект гена tat ВИЧ

Приведем один конкретный пример экспериментальной системы, в которой был впервые открыт транс-активирующий эффект гена tat ВИЧ. Это система анализа с переносом испытуемого генетического материала в виде плазмид в другие модельные клетки. Она часто используется и в других работах по молекулярной генетике и называется «CAT» (от английского «chloramphenicol acetyl transferase» – хлорамфеникол ацетил трансфераза. Этот бактериальный фермент – CAT – отсутствует в клетках млекопитающих. Поэтому его используют как маркерный фермент в опытах по трансфекции каких-либо генетических конструкций в клетки млекопитающих: если эти клетки после трансфекции в них плазмиды, несущей кроме прочего ген хлорамфеникол-ацетил трансферазы, приобретают способность катализировать биохимическую реакцию, специфичную для фермента CAT, то есть превращение хлорамфе-никола в ацетил-хлорамфеникол, то это указывает на то, что трансфекция удалась и плазмида функционирует, то есть с ее генов идет транскрипция и трансляция функционально полноценного продукта. В качестве субстрата для CAT в среду, где культивируют клетки, добавляют меченый радиоактивным углеродом (14)С хлорамфеникол. Результат опыта регистрируют как определение в среде продукта превращения хлорамфеникола, а именно его ацетилированную форму, методом тонкослойной хроматографии, которая позволяет качественно и количественно различать хлорамфеникол и ацетил-хлорамфеникол. В опытах в лаборатории W. Haseltine в клетки перевивной линии рака кишечника человека SW480 трансфецировали совместно две разные плазмиды. Одна из них – рВСАТ – содержала маркерный ген хлорамфеникол-ацетил-трансферазы, соединенный с длинным концевым повтором LTR генома ВИЧ,начиная с нуклеотида N +81 (по сайту для рестриктазы Hind III). Уже было известно, что, как и у других ретровирусов, пусть и малоизученных, у ВИЧ LTR – это «пульт управления» для вирусного генома, содержащий генетические «кнопки», предназначенные воспринимать регуляторные воздействия. Вторая плазмида под названием pSVtat, содержала 630 пар нуклеотидов из определенной области генома ВИЧ с неизвестными функциями, соединенных с промотерными последовательностями из генома вируса SV40. Результат показал, что в присутствии плазмиды pSVtat экспрессия гена хлорамфеникол-ацетил-трансферазы, содержащегося в «соседней» плаз-миде, возрастает в 40-150 раз. Отсюда заключили, что попавшая в исследование область генома ВИЧ, содержит ген, обеспечивающий мощное усиление экспрессии другого гена, расположенного в другой дискретной генетической структуре, то есть в «транс»-положении. Так был открыт ген tat и вслед за ним независимо в разных лабораториях еще шесть регуляторных генов ВИЧ.
Только небольшая часть последовательностей нуклеотидов регуляторных генов являются их «личной» обособленной собственностью. Большинство же из них, находится на «территории» структурных генов и части LTR. Индивидуальность же кодируемых белков обеспечивается индивидуальностью расположения точек сплайсинга информационных РНК. Этот молекулярно-генетический феномен называется «открытой рамкой считывания» или альтернативной «рамкой считывания». Его можно сравнить с работой портного, который из одного и того же материала по разным выкройкам способен создать совсем разную продукцию.