Регуляторные гены ВИЧ

К 1991г. открыто семь регуляторных генов в геноме ВИЧ-1, а именно: tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, vpt.
Открытие регуляторных генов ВИЧ не сводилось к экспериментальному обнаружению конкретно у ВИЧ по аналогии с другими ретровирусами эквифункциональных генов. Эта работа стала для специалистов преодолением целины, за одним маленьким и самым начальным исключением, а именно: в 1983г. W.Haseltine из Онкологического Института Dana-Farber в Бостоне в США открыл у ретровируса HTLV-1 (Т-лимфотропного вируса N 1 человека, впервые выделенного R.C. Gallo в 1981г.) ген, ответственный за трансактивацию процесса транскрипции других генов. Этот неструктурный регуляторный вирусный ген получил название tax. Через два года, в 1985г. тот же W. Haseltine нашел аналогично действующий регуляторный ген у вируса иммунодефицита человека. Этот ген получил название tat (от англ. «transactivator of transcription» – трансактиватор транскрипции). Приставка «trans» (лат.) означает «через, за» и по аналогии с номенклатурой структуры соединений в органической химии (транс- или цис-), имеет тот смысл, что продукт гена tat способен действовать на гены, расположенные не непосредственно рядом с самим геном tat, и в том числе на гены в других нитях ДНК (других хромосомах, плазмидах и т.п.).
Прежде чем привести паспортные данные регуляторных генов ВИЧ мы покажем принятую на сегодня методологию их открытия и охарактеризования свойств. Она общая для всех известных уже генов и состоит из «плюс» и «минус» экспериментов.
«Плюс» опыты отвечают на вопрос, что будет, если к чему-то, что легко измеряется, добавить испытуемый или искомый (предполагаемый) новый ген? Эти опыты проводят на модельных системах, которые называются системами переноса (трансфер-системами). При этом испытуемый генетические материал переносят в составе специально сконструированной плазмиды в бактериальные или эукариотические клетки с хорошо известной и просто регистрируемой функцией или маркерным продуктом. Напомним, что плазмидами называют способные к автономной (по отношению к хромосомам) репликации генетические структуры. Исторически Lederberg ввел этот термин по отношению к природным внехромосомным факторам наследственности у бактерий. Но в последние 20 лет, когда говорят «плазмиды», то чаще всего имеют в виду искусственно сконструированные генно-инженерные кольцевые ДНК с контролируемым составом.
«Минус»-опыты отвечают на вопрос, что будет, если какую-то часть генома удалить или видоизменить. Это опыты по так называемому направленному мутагенезу – делециям, вставкам, заменам природных нуклеотидов в заранее заданном интересующем участке генома. Таким образом, получают мутантных вирусов, позволяют им инфицировать или вводят их принудительно в клетки-мишени и регистрируют биологические эффекты. Сравнение с биологическими эффектами «домутантного» вируса, который еще принято
называть «диким типом вируса», дает возможность поставить в соответствие данную мутацию с ее биологическим последствием и «от противного» сделать вывод о естественной функции изучаемого гена.
Для примера «плюс»-опыта приведем тест-систему с хлорамфеникол-ацетил-трансферазой.
Как для «плюс», так и для «минус» опытов в первую очередь необходимо знать первичную структуру последовательности нуклеотидов генома изучаемого вируса. Кроме того, надо иметь набор ферментов рестрикции с известной специфичностью по сайту разрезания нуклеиновой кислоты. Для конструирования плазмиды надо иметь базовую структуру, содержащую все необходимые для репликации генетические элементы (промотеры, энхансеры и т.д.) и ген, кодирующий маркерный продукт, который поддается достоверному измерению в конце эксперимента. Для «плюс»-опытов нужны также перевиваемые линии клеток, в которые будут вводить плазмиды, и реактивы для трансфекции (кальций фосфат для преципитации и/или др.). Иногда в опытах используют не плазмиды, а рекомбинантные вирусы, часто вирус осповакцины, в геном которого встраивают посторонний для данного вируса, но интересующий специалиста генетический материал. Затем этот рекомбинантный вирус добавляют к культуре адекватных клеток-мишеней, которые он способен инфицировать по своей природе и тем или иным способом регистрируют факт экспрессии чужого гена.
Для опытов по направленному мутагенезу необходимы синтетические олигонуклеотиды – затравки, которые, во-первых, комплементарны заданной области генома, и, во-вторых, содержат такие изменения кодонов, которые при репликации обеспечат заданную мутацию – делецию, вставку новой(ых) аминокислоты (от), замену одной аминокислоты на другую, инверсию части последовательности и т.д.
Еще одно необходимое для таких работ оснащение – специфические ДНК-или РНК-зонды. Зондами называют фрагменты нуклеиновой кислоты, высокоспецифичные по комплементарности для исследуемого генетического материала и меченые чем-либо (флюорохромом, ферментом, радиоизотопом). Чтобы убедиться, что задуманные генетические манипуляции осуществились, ДНК рекомбинантной конструкции (плазмиды, вируса и т.п.) гибридизуют на твердой мембране со специфическим зондом и регистрируют метку. Если на твердой фазе (на подложке) фиксирована ДНК, то методика в литературе называется Southern blot, если на подложке – РНК, то методика называется Northern blot.
И, наконец, еще один общий подход для идентификации новых генов вируса. Геном вируса нарезают произвольно на фрагменты. Каждый из них по отдельности встраивают в плазмиды и получают в какой-либо биосистеме (бактериальных или эукариотических клетках) продукт, который называют рекомбинантным протеином. Его очищают, определяют в электрофорезе молекулярный вес и смотрят, нет ли в сыворотке инфицированного ВИЧ человека антител, специфично связывающихся с этим рекомбинантным протеином в иммуноферментном анализе, радиоиммуноанализе, преципитации и прочих иммуноанализах. Если оказывается, что в сыворотке инфицированных людей есть специфические антитела, то это дает основание рассматривать полученный рекомбинантный протеин как аналог естественного вирусного белка, экспрессирующегося в зараженных клетках и являющегося иммуно-генным для организма. Тогда участок генома, с которого получен рекомбинантный антиген, рассматривают как новый ген. Для подтверждения факта существования данного антигена, а значит и гена, против рекомбинантного протеина получают специфические экспериментальные антитела – моноклинальные или сывороточные – при иммунизации животных. Такие антитела используют как специфические реагенты для поиска природного антигена. Например, лизат клеток, инфицированных естественным ВИЧ, пропускают через колонку, на носителе которой иммобилизованы антитела против рекомбинантного протеина, и смотрят свяжут ли антитела что-либо из лизата, и если свяжут, то что именно. На последний вопрос отвечают методом электрофореза продукта, элюированного с колонки.
Лизат вирус-инфицированных клеток может быть проанализирован на наличие природного антигена, соответствующего рекомбинантному с использованием тех же антител против рекомбинантного белка еще методами радиоимму-нопреципитации или иммуноблота. Иммуноблот в литературе часто называют Western blot. В отличие от Southern and Northern blots, о Western blot говорят, когда на твердой фазе, то есть на подложке проводят электрофорез белков, а не нуклеиновых кислот, с последующей визуализацией компонентов. На русский язык эти названия не принято переводить как методы «Южного», «Северного» и «Западного» блотов, так как исторически первое из введенных в литературу названий, а именно Southern blot обязано фамилии автора -Southern. Остальные термины ввели уже другие авторы ради удобной четкости представления экспериментальных данных: нет необходимости вспоминать и лишний раз объяснять, что лежит на подложке – ДНК, РНК или белок -об этом говорит название метода работы, поскольку Юг с Севером или с Западом спутать трудно.