Ген env (envelope)

С гена env транскрибируется информационная РНК, которая перед трансляцией претерпевает только один сплайсинг. Размер сплайсированной РНК env составляет 4.5 килобазы. С этой РНК транслируется белок-предшественник с молекулярным весом 160 килодальтон. На N-конце этого предшественника существует гидрофобная, так называемая сигнальная последовательность аминокислот, благодаря которой данный белок направляется в секреторный аппарат клетки через эндоплазматический ретикулум. В этом компатменте клетки сигнальная последовательность отщепляется и молекула предшественника интенсивно гликозилируется. С этого этапа она называется гликопротеином 160 – (glycoprotein 160 – gp160). На С-конце gp160 имеется отрезок последовательности гидрофобных аминокислот, которые присоединяются к мембране клетки-хозяина. Затем молекула gp160 расщепляется специальной протеазой (предположительно клеточной) на две молекулы, являющиеся дефинитивными белками зрелых вирионов гликопротеин 120 (gp120) и гликопротеин 41 (gp41). Не будучи уже связаны пептидной связью, gp120 и gp41 взаимодействуют друг с другом нековалентно и экспрессируются на мембране клетки, в которой идет процесс репликации вируса. Молекулы gp41 располагаются трансмембранно. Трансмембранными они являются и в зрелом вирионе. Находящийся вне клетки N-конец gp41 является «фьюзогенным» (fusogenic domain) доменом. Он содержит гидрофобные аминокислоты N 27-34. Взаимодействие именно этого участка gp41 с мембранами других клеток обеспечивает образование синцития между инфицированной ВИЧ клеткой и какой-либо другой клеткой, «притянутой» на близкое расстояние в результате каких-либо специфических взаимодействий.
Расщепление gp160 на gp120 и gp41 происходит по последовательности аминокислот Arg-Glu-Lys-Arg. Эта последовательность является трипсинофильной. Она характерна и для других известных ретровирусов и консервативна по формуле «Arg-X-Lys/Arg-Arg». McGune J.M. et al. [1988] методом направленного мутагенеза изменили 45 пар нуклеотидов, кодирующих этот трипсинофильный сайт в gp160. Таким образом, получили мутантный вирус (штамм получил название RIP7/mut10) с химотрипсинофильным сайтом для протеазы Gly-Glu-Glu-Phe. По другим свойствам (интенсивности репликации, процессингу РНК, экспрессии всех белков, сборке вирионов, электронно-микроскопической морфологии вирионов) этот мутант не отличался от исходного клона интактного ВИЧ НХВ2. Однако у мутантного вируса gp160 не расщеплялся и gp120 и gp41 оставались ковалентно связанными. При этом мутантные вирионы становились биологически неопасными, они утрачивали способность проникать в клетки-мишени путем слияния мембран вируса и клетки. Если мутантов искусственно трансфецировали в клетки линии COS-1, то эти клетки продуцировали неинфекционных и нецитопатогенных вирионов. Эти же авторы показали также, что короткие пептиды, содержащие последовательность аминокислот Phe-Phe-Arg, могут ингибировать процесс слияния (fusion) вируса с клеткой. Fusion-последовательности на N-конце gp41 высоко консервативны у разных изолятов вируса. Предполагают, что возможно для них существует специальный рецептор на клетках, иной, чем CD4.
На том же N-конце трансмембранного белка gp41 идентифицирован иммунодоминантный эпитоп, на который вырабатываются антитела у большинства инфицированных людей: в США у 201 из 203 [Schrier R.D. et al., 1988]. Этот эпитоп имитируется синтетическим пептидом из 12 аминокислот, N 589-606: Leu-Gly-Leu-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys. Минимальный антигенсвязывающий участок состоит из 7 аминокислот: GCSGKLI.
В молекуле gp160 имеется 7 цистеинов. Мутации по любому из этих остатков Cys приводят к утрате инфекционности вируса. Именно остатки цистеина участвуют в образовании дисульфидных связей. Причем дисульфид-ные связи могут образовываться и между разными молекулами gp160, что приводит к образованию олигомерных комплексов. Существование таких олигомерных комплексов показали Owens R., Compans R. [1990] в опытах по фракционированию в градиенте плотности сахарозы и электрофорезом в полиакриламидном геле продуктов экспрессии гена ВИЧ gp160 в составе рекомбинантного вируса осповакцины «VV-envl». Олигомеризации подвергается большая часть синтезированного gp160 – 85-95%. Эти олигомеры не способны подвергаться нормальному расщеплению до функционально зрелых продуктов вириона ВИЧ – gp120 и gp41, что отличает вирус ВИЧ от, например, вируса везикулярного стоматита или вируса гриппа, у которых олигомеризация оболочечных белков – нормальный процесс, необходимый для их внутриклеточной транспортировки и включения в зрелые вирионы. У ВИЧ эта олигомеризация является одной из «ошибок» вируса, так как имеет последствием низкий КПД в продукции оболочечного белка инфекционных вирионов – 5-15%.
Антитела кроликов, иммунизированных конъюгатом названного пептида (NN 589-606) с носителем – гемоцианином улитки, проявляют вируснейтрализующую активность в культурах восприимчивых клеток in vitro. Т-лимфоциты пролиферировали на этот пептид только у 7 из 27 обследованных инфицированных людей. Причем в данном случае пролиферативный ответ идет и в присутствии специфических антител к пептиду, то есть в комплексе «антиген-антитело» детерминанты для Т-лимфоцитов не инактивированы.
Важной характеристикой гена env является необыкновенно высокая изменчивость состава его нуклеотидов у разных изолятов вируса. Степень изменчивости неодинакова в разных участках молекулы кодируемого оболочечного белка: существуют консервативные домены, в которых 90-100% аминокислот одинаковы у всех известных жизнеспособных изолятов вируса ВИЧ, тогда как в вариабельных участках молекулы воспроизводится только 20-30% аминокислот. Есть и промежуточные по степени консерватизма отрезки gp120 и gp41.
В молекулах белков оболочки – gp120 и gp41 картировано не менее 20 функционально значимых участков последовательностей аминокислот или, как их называют, сайтов или эпитопов. Последний термин характерен для иммунологических работ и обозначает тот участок в молекуле антигена, с которым непосредственно связывается комплементарный участок антитела или рецепторов лимфоцитов (он называется паратопом). Мы приведем здесь список известных эпитопов gp120 и gp41 для того, чтобы возникло общее представление. Отметим, что в данном случае имеются в виду только первично-структурные (еще их называют последовательностными или непрерывными (continuous) ) эпитопы. Они идентифицированы в экспериментальных работах по имитации антигенных эпитопов синтетическими пептидами или рекомбинантными фрагментами gp120, gp41 или gp160, а также в работах по направленному мутагенезу (вставкам, делециям, заменам) в клонированных генах env с последующим изучением функциональных и иммунологических последствий таких мутаций. В разных работах номера аминокислот по концам отрезков эпитопов несколько различаются, что зависит от произвольно выбранных авторами фрагментов для химического или генноинженерного синтеза. Подробно конкретные работы мы приведем в разделах о гуморальном и клеточном иммунном ответе на env, иммунопатогенезе.