Искусственные генетические построения

Целый геном провируса или его всевозможные фрагменты встраивают с помощью определенных рестриктаз и лигаз (ферментов, сшивающих концы нуклеиновых кислот) в способные к репликации генетические конструкции. Это могут быть фаги, другие вирусы, например, вирус осповакцины или вирус папилломы быка, а также плазмиды – кольцевые ДНК, способные к автономной от основного генома клетки репликации. В последнее время создается так много искусственных генетических конструкций, что они не всегда могут строго соответствовать давно введенным исходным определениям плазмид или чего-то еще. Поэтому в обобщенном виде искусственные генетические построения стали называть векторами экспрессии в том случае, если они содержат кроме заданного изучаемого генетического материала комплект сервисных генов, необходимых для обеспечения репликации и индикации продукта (промотеры, энхансеры, последовательности с известными сайтами рестрикции, а также маркерные гены, кодирующие какой-либо продукт, который легко и однозначно идентифицируется). Примером часто используемого маркерного гена является ген хлорамфеникол-ацетил трансферазы – CAT – (cloram-phenicol acetil transferase) – бактериального фермента, не встречающегося в клетках эукариот. CAT катализирует ацетилирование хлорамфеникола. В среду вводят меченый (14)С-хлорамфеникол. Наличие ацетилированного продукта определяют методом тонкослойной хроматографии. Вектор экспрессии вводят в клетки бактерий, дрожжей или в технологичные перевивные клетки эукариот (насекомых, млекопитающих). Методов введения существует несколько. Если вектор экспрессии получен на основе фага или вируса, то он сам просто инфицирует адекватные клетки-мишени. Если генетическая конструкция – плазмида, то ее вводят в выбранные клетки трансфекцией с помощью преципитации фосфатом кальция или диэтиламиноэтил-декстраном, или электропорацией мембраны клетки-мишени. Живая «фабрика» нарабатывает путем пролиферации собственную биомассу и вместе с ней экзогенный вектор экспрессии и продукты трансляции с его генов. Бактериальные или эукариотические клетки-носители вектора экспрессии рассевают по одной. Это и называется клонированием. Отсюда метод в целом носит название молекулярного клонирования. Отбирают клоны клеток, нарабатывающие интересующие гены и их продукты. Отбор ведут либо методами гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими зондами ДНК и РНК, специфичными для интересующих генов, либо по маркерному продукту, который определяют биохимическими или иммунологическими методами. Отобранный клон клеток наращивают в массовой культуре и выделяют из них искомые гены и/или их продукты, которые называют рекомбинантными белками, в препаративных количествах, достаточных для анализа последовательности нуклеотидов (так называемого сиквенса – от английского «sequence» – ряд, последовательность), а также использования рекомбинантных белков в качестве антигенов в иммунодиагностических тест-системах и различных экспериментальных работах.
Именно методом молекулярного клонирования были выявлены многочисленные регуляторные последовательности нуклеотидов в геноме ВИЧ и регуляторные белки, которых нет в составе зрелых вирионов и которые синтезируются и функционируют в ходе репликации вируса в клетке-хозяине.
Сравнение последовательности нуклеотидов генома в различных изолятах ВИЧ, то есть клонов вируса, выделенных от разных людей и/или в разное время, показало, что процент вариаций последовательностей колеблется от 1% до 25%. Изменчивость ВИЧ необычно высока по сравнению с известными вирусологам диапазонами изменчивости других вирусов. Вслед за генетическими различиями соответственно варьируют и фенотипические и биологические свойства различных изолятов ВИЧ: антигенные, свойство тропизма к разным клеткам-мишеням, потенциальные возможности к репликации, качество и интенсивность цитопатогенных эффектов, продолжительность латентной стадии инфекции, чувствительность к различным ферментам рестрикции. Таким образом, можно сказать, что существует не один вирус иммунодефицита человека, а множество вирусов иммунодефицита, которые наряду с разнообразием имеют общие консервативные характеристики состава, строения и конечных биологических эффектов, то есть патогномоничные свойства, позволяющие рассматривать это множество вирусов как относительно единую таксономическую единицу. При этом параметр поразительно высокой изменчивости необходимо иметь в виду , на каждом шагу: при анализе патогенеза заболевания, при диагностике, при разработке вакцин, при подборе лекарственных средств, при сборе эпидемиологических данных и т.д.
Далее на сайте мы приведем описание общих характеристик морфологии, состава и строения возбудителя СПИД.