Состав и строение вируса СПИД

Полная нуклеотидная последовательность генома ряда изолятов ВИЧ, следовательно, и полные последовательности аминокислот белков ВИЧ (дедуктивно рассчитанные по последовательности нуклеотидов и подтверждаемые прямым сиквенсом (определением последовательности аминокислот) были определены на редкость быстро – в первые полтора года после выделения ВИЧ в препаративных количествах. Первые работы были выполнены в лаборатории R.C. Gallo и в нескольких других лабораториях в США и в Европе, в первую очередь, в лаборатории W. Haseltine в Онкологическом институте Dana-Farber. Эти результаты получены в итоге огромного количества научно-ремесленной работы. Возможность ее проведения зависела не только от важности задач и усердия ученых, но, главным образом, от того, что к 1980г. молекулярная биология и иммунология уже владели мощным методическим аппаратом, и, в первую очередь, методами молекулярного клонирования.
В науке есть рабочая точка зрения, что метод решает все. При этом каждый признает, что диалектическая половина всего принадлежит идее. Но значимость наличных знаний о строении вируса, их соответствие природе вещей могут быть оценены только через понимание методов, с помощью которых добыты эти знания. Поэтому прежде чем привести сведения о составе и строении ВИЧ перечислим основные методы его изучения.
1. Культивирование in vitro клонированных технологичных линий клеток, в которых ВИЧ эффективно размножается с накоплением препаративных количеств. Отбор и культивирование различных линий клеток, чувствительных к инфекции ВИЧ, на которых можно изучать цитопатогенные и другие эффекты воздействия вируса и его отдельных белков.
2. Выделение чистого препарата вируса, главным образом, методами ультрацентрифугирования в растворах сахарозы.
3. Анализ состава вируса биохимическими методами фракционирования белков и нуклеиновых кислот, главным образом, различными видами хроматографии и электрофорезов в гелях. Определение молекулярных весов белков вируса. С целью установления наличия биохимических модификаций белков вируса, например, фосфорелирования, гликозилирования, миристилирования и т.п., в культуру клеток, в которых идет репликация вируса, вводят специфические метаболиты, меченые радиоизотопами. Затем фракционированный вирус (хроматограммы или электрофореграммы) анализируют методами радиоавтографии, радиоиммунореципитации или другим радиоанализом и таким образом узнают, какой компонент вируса претерпевает ту или иную биохимическую модификацию.
4. Получение антител, главным образом моноклональных и иногда сывороточных, против отдельных очищенных антигенов вируса или синтетических пептидов, воспроизводящих естественные антигенные детерминанты ВИЧ. Специфические антитела используют как идентификационные реагенты в самых разных вариантах иммуноанализов с целью определения наличия в материале вируса или его отдельных антигенов и генов.
5. Анализ специфических противовирусных антител в крови и других биологических жидкостях людей методами иммуноферментного анализа, радиоиммуноанализа и им подобных с использованием антигенов вируса, рекомбинантных и синтетических соответствующих антигенов. Анализ антител методом иммуноблота (Western blot), то есть анализ связывания искомых антител с белками вируса, фракционированными методом электрофореза с переносом на твердую фазу типа нитроцеллюлозных мембран. Реакцию проявляют, как правило, иммуноферментным методом.
6. Исследование морфологии и морфогенеза вируса методами электронной микроскопии тонких срезов (thin section); с негативным окрашиванием (nagative staining); туннельной электронной микроскопии; электронной микроскопии поверхностных реплик (surface replicas) и, наконец, иммуноэлектронной микроскопии с применением специфических моноклональных антител к отдельным известным компонентам вируса.
7. Наиболее весомый по информационному вкладу метод исследования -молекулярное клонирование. Из инфицированных клеток (технологичных культивируемых линий) выделяют геном провируса ВИЧ. Провирусом называют интегрированную в геном клетки-хозяина ДНК-копию с геномной РНК вируса. В настоящее время известно более 60 ферментов, расщепляющих ДНК в местах со строго известными последовательностями нуклеотидов (как правило, тетра- или гексануклеотидные последовательности). Эти ферменты называются рестриктазами.
Приведем список часто используемых рестриктаз, поскольку их обозначения включают в названия векторов экспрессии, которые будут встречаться и в нашем тексте: Hind III, BamH I, SacI, EcoRI, Kpnl, Smal, Xbal, Sail, PstI, SphI, Sau3A, Mbol, Sail, PSmal, Ndel, Narl, AflHI, AatI, Aatll, AccI, Ahall, Ahalll, Apal, AsuII, Ball, BanI, Banll, Banlll, Sstl.